LAB_Rozmrazování produkčních buněk

Vložíme sterilní médium do vodní lázně nastavené na 37°C na cca 30 minut.

Zapneme flowboxu a důkladně jej vyčištěníme 70% ethanolem.

Sterilně vložíme do flowboxu stojánek s 15ml falkonami.

1 falkona je vždy přiřazená jen k jedné kryovialce.

Do každé falkony sterilně napipetujeme 6 ml nahřátého média.

Každou falkonu označíme ID číslem dle příslušné kryovialky..

Kód nalezneme v systému BMTIC evidence CUBU: ic.benemeat.com/evidence.

Lokalizace buněk

Vybereme konkrétní ID kryovialek s produkčními buňkami určených pro Minifactory (systém BMTIC evidence).

Fyzicky kryovialky odebereme z místa jejich dlouhodobého skladování, z mrazáku nebo dewarky s N2 (l).

Při odebírání kryovialek je třeba dbát vlastní bezpečnosti - používejte speciální izolační rukavice. pracujte rychle a precizně a nemějte mrazák či dewarku zbytečně dlouho otevřené.

Rozmrazení kryovialek

Umístíme kryovialky do vodní lázně tak, aby byly, co nejvíce ponořené, ale jejich vršek zůstal suchý.

Necháme je 2-3 minuty romzrazit.

Je žádoucí, aby při vytažení z vodní lázně zůstaly ve vialkách malé kousky ledu.

Proplach a centrifugace

Kryovialky sterilně (otřené od vody z lázně a postříkané 70% ethanolem) umístíme do připraveného flowboxu.

Celý obsah vialky přepipetujeme pomocí automatické pipety (1ml) do příslušné falkony s médiem.

Řádně falkony zavřeme, aby dobře těsnily a dáme je do centrifugy.

V tomto kroku je třeba dbát na správné rozložení hmotnosti (!!!).

Buňky necháme centrifugovat na 220g po dobu 8 minut.

Příprava erlen

Každá kryovialka obsahuje předem daný počet buněk (nejčastěji 200 milionů buněk). Seeding čerstvě rozmražených buněk je VŽDY 1000 cells/ul. To znamená že 200milionů buněk se umístí do 500ml erleny s 200ml média. 400milionů buněk zase do 1000ml erleny se 400ml média.

Příslušné erleny se naplníme pomocí sérologických pipet nahřátým médiem o objemu vždy o 10 ml nižším, tzn 190ml nebo 390ml.

Erleny jsou potřeba označit novým ID číslem, který vygeneruje BMTIC po akci "unfreeze" u příslušné kryovialky.

Buňky do erleny

Po centrifugaci bude viditelně oddělená peleta buněk od média.

Falkony pak šetrně přemístíme zpět do flowboxu.

Pozor na třes či pád falkon, buňky by se opět promíchají s médiem a krok centrifugace by pak bylo potřeba zopakovat.

Médium se odseparujeme od pelety buněk odlitím do liquid waste či odpipetováním.

Pozor, aby nebyly odsáty i samotné buňky.

K peletě buněk přidáme pomocí 10ml sérologické pipety 9 ml média a pořádně propipetujeme.

Celý obsah tou samou pipetou přeneseme do přichystané erleny tak, aby nedošlo ke kontaktu mezi pipetou a erlenou.

Kultivace

Takto připravené erleny kultivujeme v inkubátoru.

Zkontrolujeme, že je inkubátor správně nastaven a má odpovídající parametry.

Teplota 37°C.
Vlhkost cca 90%.
Atmosféra 5% CO2.
Shaker 125rpm.

Buňky jsou po rozmrazení pomalejší a mají horší viabilitu, to je normální. Je tedy potřeba je po 3-4 dnech zpasážovat na vyšší denzitu (1000 cells/ul).

Přípravné práce

Vložíme sterilní médium do vodní lázně nastavené na 37°C na cca 30 minut.

Zapneme flowboxu a důkladně jej vyčištěníme 70% ethanolem.

Sterilně vložíme do flowboxu stojánek s 15ml falkonami.

1 falkona je vždy přiřazená jen k jedné kryovialce.

Do každé falkony sterilně napipetujeme 6 ml nahřátého média.

Každou falkonu označíme ID číslem dle příslušné kryovialky..

Kód nalezneme v systému BMTIC evidence CUBU: ic.benemeat.com/evidence.

Lokalizace buněk

Vybereme konkrétní ID kryovialek s produkčními buňkami určených pro Minifactory (systém BMTIC evidence).

Fyzicky kryovialky odebereme z místa jejich dlouhodobého skladování, z mrazáku nebo dewarky s N2 (l).

Při odebírání kryovialek je třeba dbát vlastní bezpečnosti - používejte speciální izolační rukavice. pracujte rychle a precizně a nemějte mrazák či dewarku zbytečně dlouho otevřené.

Rozmrazení kryovialek

Umístíme kryovialky do vodní lázně tak, aby byly, co nejvíce ponořené, ale jejich vršek zůstal suchý.

Necháme je 2-3 minuty romzrazit.

Je žádoucí, aby při vytažení z vodní lázně zůstaly ve vialkách malé kousky ledu.

Proplach a centrifugace

Kryovialky sterilně (otřené od vody z lázně a postříkané 70% ethanolem) umístíme do připraveného flowboxu.

Celý obsah vialky přepipetujeme pomocí automatické pipety (1ml) do příslušné falkony s médiem.

Řádně falkony zavřeme, aby dobře těsnily a dáme je do centrifugy.

V tomto kroku je třeba dbát na správné rozložení hmotnosti (!!!).

Buňky necháme centrifugovat na 220g po dobu 8 minut.

Příprava erlen

Každá kryovialka obsahuje předem daný počet buněk (nejčastěji 200 milionů buněk). Seeding čerstvě rozmražených buněk je VŽDY 1000 cells/ul. To znamená že 200milionů buněk se umístí do 500ml erleny s 200ml média. 400milionů buněk zase do 1000ml erleny se 400ml média.

Příslušné erleny se naplníme pomocí sérologických pipet nahřátým médiem o objemu vždy o 10 ml nižším, tzn 190ml nebo 390ml.

Erleny jsou potřeba označit novým ID číslem, který vygeneruje BMTIC po akci "unfreeze" u příslušné kryovialky.

Buňky do erleny

Po centrifugaci bude viditelně oddělená peleta buněk od média.

Falkony pak šetrně přemístíme zpět do flowboxu.

Pozor na třes či pád falkon, buňky by se opět promíchají s médiem a krok centrifugace by pak bylo potřeba zopakovat.

Médium se odseparujeme od pelety buněk odlitím do liquid waste či odpipetováním.

Pozor, aby nebyly odsáty i samotné buňky.

K peletě buněk přidáme pomocí 10ml sérologické pipety 9 ml média a pořádně propipetujeme.

Celý obsah tou samou pipetou přeneseme do přichystané erleny tak, aby nedošlo ke kontaktu mezi pipetou a erlenou.

Kultivace

Takto připravené erleny kultivujeme v inkubátoru.

Zkontrolujeme, že je inkubátor správně nastaven a má odpovídající parametry.

Teplota 37°C.

Vlhkost cca 90%.

Atmosféra 5% CO2.

Shaker 125rpm.

Buňky jsou po rozmrazení pomalejší a mají horší viabilitu, to je normální. Je tedy potřeba je po 3-4 dnech zpasážovat na vyšší denzitu (1000 cells/ul).